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问题
[固相萃取] SPE常见操作的背后原理,您知道吗?
浏览量:130 发布时间:2020-09-24
答案

不仅仅要知道怎么做,还必须知道为什么这么做,透过现象看本质,透过原理,来解答SPE小柱操作的常见疑惑,今天小编就透过SPE背后的原理,告诉您SPE为什么有这样哪样的操作要求,一起来围观吧!

01 为什么SPE小柱操作要强调流速?

答:SPE小柱的填料装填压实以后,形成柱床,当溶剂流过小柱,速度过快将导致两个问题,一个问题是对于键合相填料,由于流速快而使得其不能充分浸润舒展,因而导致其保留活性降低;其次过快的流速导致小柱可能形成沟渠,使得填料未被充分浸润,降低了吸附填料与样品的接触面积,影响了目标物质的传质过程,因而导致回收率降低。对于0.5-3.0mL/min的小柱流速通常是不会产生沟渠效应的,另外沟渠的形成与柱床高度有关,对于薄膜型的萃取膜片或者膜盘,由于横截面大,柱床低,在高流速下不会导致严重的沟渠效应,因此适合在高流速的大体积水样的富集,对于离子交换和特异性吸附,填料和分析目标物的相互作用时间比常规小柱长,流速的控制,确保了好的保留效果。

【沟渠效应】

SPE小柱的填料装实后,当通过小柱的流速较低时,液体是以层流的方式通过填料层,将填料层浸润充分,湿润的液面截层逐级向前推进,见附图;当流速过大的时候,而柱床厚度较高时,可能会在填料内部形成沟渠通道,液流将通过沟渠,快速通过小柱,而使得填料的浸润变得不充分,这样将使得体与填料的接触面积大大降低,严重影响填料对目标物质的保留效果。

图一 SPE形成沟渠和田间灌溉的沟渠

图二 SPE正常层流和沟流通过小柱填料

02 溶剂环境的pH怎么影响化合物在小柱上的保留,为什么我们要关注化合物的pKa值,在C18小柱中需要考虑这些因素吗?

答:首先我们来说一下,Ka指的是酸度系数,又名酸离解常数,可以理解为酸离解H离子的能力,而pKa=-lgKa,对于酸,在环境pH下存在如下平衡:

左边的A-/HA,实际是指溶剂环境下,离子态和分子态的比例,右边反映了左侧两者的转化关系,取决于(pH-pKa)的数值大小。对于离子交换小柱,保持目标物的离子化而非分子态,是一个关键点,这对于离子交换作用机理的交换柱,将直接关系到其实验成败。而对于硅胶键合C18小柱的萃取,由于硅胶(—SiOH)不能完全“封端”,在pH大于4.0的情况下,硅胶都会带上负电荷,因而会使得能电离的化合物与硅胶作用,增强了这种附带的次级作用理(主作用力为非极性相互作用力),而使得此类物质在硅胶-C18上的保留增强,若只考虑C18的非极性作用力,必然会导致回收结果的不尽人意。

03 中性氧化铝,酸性氧化铝、碱性氧化铝,怎么区分?

答:Al2O3 的主要作用力是通过金属铝中心与化合物的羟基形成氢键来吸附,或者通过离子交换作用。中性氧化铝(Al-N):pH为6.5,中性氧化铝主要通过铝原子中心与带有高负电荷的杂原子作用,如:N、O、P、S及富电子的芳香族化合物。

先理解酸化后和碱化后的氧化铝,氧化铝的性能变化:

Al2O3 + 6HCl = 2AlCl3 + 3H2O;

Al2O3 + 2NaOH= 2NaAlO2(偏铝酸钠) + H2O

酸化的氧化铝和碱化的氧化铝,使得氧化铝表面的电荷性发生改变,如酸性氧化铝带正电荷的中心容易吸附阴离子,并且产生偶极作用,吸附极性化合物;而碱性则吸附极性和含阳离子官能的化合物。

04 为什么在农残检测过程中GCB常见于净化模式,而不用于富集模式?

答:SPE的净化模式常被用来吸附杂质,而富集模式常被用来吸附目标物质,GCB是一种石墨化碳黑,是将炭黑在惰性气氛下加热到2700-3000℃烘焙而成,它由六个碳原子构成平面六角形,并且层叠而成,对于芳香平面分子,很容易嵌入,而具有较强吸附芳香化合物的选择性,对于其他分析物也有较好的吸附性能,填料的吸附与解吸附的性能将直接影响填料的使用范围,对于GCB而言,其吸附性能较强,但是解吸附的可逆性稍差,需要选择合适强度的溶剂来释放被吸附的物质,因而造成了解析溶剂匹配较为困难,由于其对色素等的优秀吸附性能,因而在农残样品处理中,常用来吸附色素等杂质,而不是选择用来保留目标化合物。

05 HLB小柱为什么与传统的硅胶键合C18不一样,厂商建议可以不活化平衡?

答:SPE小柱活化平衡的目的有两个,一是使得键合官能团填料的湿润和舒展,使之保持对目标化合物的最大吸附活性,另外一个目的就是去除填料本身可能引入的杂质。我们知道硅胶键合C18,是在硅胶微球表面键合疏水性的C18官能团,为了使得其保持对目标物的充分的吸附活性,需要在湿润的环境上样,在填料表层形成的液膜(活化平衡)和上样的溶剂分子有良好的相容性,目标物在膜间进行传质,与键合C18发生疏水作用而保留,C18本身不具备水浸润性,直接上水样,C18蜷缩,而且强的疏水性导致其与溶剂中的目标物质接触传质变得困难,因此活化平衡必不可少,HLB小柱采用聚合物改性材料,增加了亲水基团,使得在上样溶剂时就能很好的和水溶剂互溶,因而填料的官能团能在上样溶剂的环境下就与目标物分子充分接触,而发生传质,使得目标物质被充分保留住。

06 淋洗步骤通常需要干燥,这个原因是什么?

答:淋洗液通常要干燥,主要作以下考量:

1.通常由于反相萃取在化合物的前处理中使用的比较多,正如反相色谱在色谱中作为常见的分离方法一样,在反相萃取中的淋洗液常为水相或者含水的缓冲溶液,去除水份,可以便于后续干燥浓缩步骤。
2.有的项目,在淋洗步骤完成后,直接用一定体积的洗脱液,比如1ml的甲醇洗脱,此过程将洗脱与定容集为一步处理,前一步的处理必然对洗脱步骤的定量结果产生影响。
3.便是溶剂互溶问题,当淋洗步骤使用的溶剂极性与洗脱溶剂的极性差异较大时,会产生乳化分层,洗脱阻力大,洗脱液被稀释的风险等,导致洗脱效果的差异,以致于实验结果的失败。

07 我们在使用硅胶键合填料类型的色谱柱的时候,出于对色谱学的常识,知道了硅胶键合填料一般厂商建议的pH使用范围为2-8,那么对于使用硅胶键合的填料的固相萃取小柱,是否需要严格遵守这样一条规定?

答:首先,我们需要了解到,厂家建议的pH2-8的耐受范围,是为了保证色谱柱的正常使用寿命,硅胶键合相在超出耐受的pH范围使用,会导致键合相与硅胶基质的断裂,因此会损害色谱柱柱效和保留特性,但是我们知道这个pH耐受值范围外的溶剂对于色谱柱的影响,主要是一个积累性的过程,在溶剂冲刷下,逐渐溶解而导致色谱柱性能改变和不可逆,寿命减短。SPE小柱和色谱柱的一个差异就是,SPE是一次性消耗品,在耐受的溶剂范围外,短暂时间的溶剂冲刷对于小柱的保留特性影响甚微,并不会导致其保留显著差异,因此其使用的pH范围更宽,一般可以在pH值范围1-10使用,而不会导致其结果的差异性。

 

 

 
                                                                                                             
 

 

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