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[其他] 亲水作用(Hilic)色谱大揭秘
浏览量:58 发布时间:2020-11-13
答案

亲水作用(Hilic)色谱,有时被称为“含水正相色谱”,有时又被称为“反反相色谱”,简单来说,是极性的固定相和极性的流动相组成,参考表1,在固定相方面,看似和正相色谱一样,那么,同一款色谱柱是否既可以用于正相色谱,又可以用于Hilic色谱?在流动相方面,和反相色谱接近,那两种模式保留行为和流动相对保留的影响规律有什么差异?你对Hilic色谱是否也疑惑重重?接下来让我们一起揭开亲水作用 (Hilic)色谱的神秘面纱吧。

表1 反相、正相、Hilic色谱对比

一、Hilic简介

1.1流动相

在大多数的Hilic分离中,采用的流动相为含有少量水/缓冲液与有机相混合(典型的是乙腈),水的比例为3%-40%之间。

水的比例不低于3%是由于Hilic色谱的保留机理决定的,普遍认为Hilic色谱流动相中的水会被吸附到极性固定相的表面形成水膜,然后分析物在水膜和流动相之间进行液液分配作用,加上极性官能团和固定相之间的氢键作用力,离子官能团之间的静电作用力等,实现被分析物的保留。水膜的作用非常重要,所以Hilic流动相中至少含有3%的水。当水的比例大于40%时,保留一般很弱(k≈0)。

1.2固定相

应用于Hilic色谱的固定相有:纯硅胶柱、氨基柱、二醇基柱、酰胺基柱等。纯硅胶柱有固定相不易流失的优点,在使用CAD、ELSD和LC-MS检测器时,最受欢迎;氨基柱,在Hilic色谱中的应用,特别适合碳水化合物(糖类)分离;二醇基柱,亲水性很好,可以提供不同的选择性。

二、Hilic和正相色谱相比

2.1固定相的区别

同样是Silica,NH2,Diol柱,与用于正相色谱中的色谱柱不同,专为Hilic色谱设计的色谱柱,可以用于水/有机物的流动相中,换句话说,Hilic色谱对固定相的耐水性要求更高,否则会因固定相的水解,出现基线噪音大、色谱柱寿命短等问题。所以用于正相色谱中的色谱柱,不一定能用于Hilic色谱。而适用于Hilic色谱的色谱柱,可以用于正相色谱中。

典型案例:

Athena NH2-RP用于糖类分析,CAD检测时,能改善基线噪音。而国产A/C品牌、进口B品牌氨基柱由于键合相水解,基线噪音大大增加。

图1 几款氨基柱流失性对比

采用电喷雾检测器(CAD),考察了国产A/C品牌、进口B品牌氨基柱和安谱的CNW Athena NH2-RP在乙腈:水(70:30)的条件下的稳定性,结果表明,Athena NH2-RP的流失性更低,稳定性更好,是糖类分析的理想之选。

图2 Athena NH2-RP乳糖分析稳定性测试

Athena NH2-RP 4.6 × 250mm,5μm (LAEQ-462568)测试乳糖,连续进混合标准品,500针后,蔗糖和乳糖的拖尾因子和保留时间稳定,蔗糖的柱效基本保持不变,乳糖的柱效降低6%,Athena NH2-RP色谱柱在含水流动相中分析糖类物质具有优异的稳定性。

正相色谱主要用于极性大的脂溶性化合物(图3),而Hilic色谱主要用于极性大的水溶性化合物(参考图2 Athena NH2-RP用于乳糖分析)。

图3 Athena silica硝基苯胺异构体分析

2.3总结

和正相色谱相比,用于Hilic色谱中的Silica/NH2/Diol等色谱柱耐水性更好,Athena NH2-RP在Hilic色谱糖类分析中表现优异。

对于极性强的化合物,如果在正己烷、异丙醇中溶解度较好,推荐用正相色谱,如果在水中溶解度较好,推荐用Hilic色谱。

三、Hilic和反相色谱相比

3.1保留行为差异

极性较强的尿素,在Athena C18-WP (LAEQ-462572)没有保留,而在Athena NH2-RP (LAEQ-462568)可以很好的保留。和反相色谱相比,Hilic色谱对极性大的水溶性化合物保留能力更强。

3.2流动相中水的洗脱强度

以Athena NH2-RP 4.6 × 250mm,5μm (LAEQ-462568)对糖类物质的分析为例。

乙腈/水(75:25)

1.果糖    2.葡萄糖    3.蔗糖   4.麦芽糖

应用:蜂蜜  中国药典2020年版一部  P374

乙腈/水(70:30)

1.蔗糖    2.乳糖

应用:乳糖  中国药典2020年版四部  P690

对比蜂蜜和乳糖应用,采用同一支Athena NH2-RP 4.6 × 250mm,5μm (LAEQ-462568)色谱柱,流动相从乙腈/水(75:25)变为乙腈/水(70:30)后,蔗糖的出峰时间从14.008min缩短至8.840min,流动相中水相比例增加,目标化合物出峰变早。我们知道,反相色谱中,流动相中水相比例增加,目标化合物的出峰会变晚。在Hilic色谱中,流动相中的水相部分表现为强溶剂,这和传统的反相色谱完全相反。

3.3总结

对于极性大的亲水性化合物,在反相色谱中很难保留,可以用Hilic色谱增加保留。

在反相色谱中,流动相中的水相部分表现为弱溶剂,而在Hilic色谱中,水表现为强溶剂。

四、Hilic色谱总结

Hilic色谱作为正相和反相色谱的补充,采用极性的固定相和流动相,在分析极性强的水溶性化合物中有很大优势。

通常情况,流动相中水相比例为3%-40%,水相比例太高,一方面目标化合物保留太弱,另一方面加快键合相的水解。

固定相的耐水解性要求更高,如Athena NH2-RP在Hilic色谱中特别适合糖类物质的分析,基线噪音小,色谱柱寿命长。

 

 

 

 
                                                                                                             
 

 

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